Creation of hypoallergenic mustard (Brassica juncea) through genome editing and development of precise base editing tools for plants

verfasst von

Dingbo Zhang

betreut von

Jens Boch

Abstract

Eine verbesserte landwirtschaftliche Sicherheit durch neue Züchtungsverfahren ist dringend erforderlich, um den Zugang zu nahrhaften Lebensmitteln weltweit zu verbessern. Das Genom-Engineering mit Hilfe von CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Technologien oder TALE (transcription activator-like effector)-Technologien bietet die einzigartige Möglichkeit, gezielt Gene für eine präzise Züchtung zu verändern. Diese Technologie ist vielversprechend für verschiedene Anwendungen in der Allergieforschung. Das Hauptallergen Bra j I aus braunem Senf (Brassica juncea) ist ein Saatgut-Speicherprotein, das zur 2S-Albuminfamilie gehört. Ein Ziel dieser Arbeit war die Schaffung einer hypoallergenen Senfsorte durch den Einsatz von Genome Editing-Techniken und ein zweites Ziel war die Entwicklung neuer Baseneditoren für Pflanzen. Zunächst wurden zwei CRISPR/Cas9-Konstrukte mit Multiplex-Single-Guide-RNAs eingesetzt, um große Deletionen oder Frameshift-Mutationen in den beiden Homöologen Bra j IA und Bra j IB in zwei Linien des braunen Senf (Terratop und CR2664) zu induzieren. In den transgenen T0-Senfpflanzen wurden hohe Mutationseffizienzen beobachtet. Das Bra j IB-Allel wies in vier Linien große Deletionen zwischen 566 und 790 bp auf. Außerdem wiesen neun von 18 Terratop-T0-Linien kleine Indels in den Zielregionen auf. In ähnlicher Weise wiesen 14 der 16 analysierten CR2664 T0-Linien Indels auf, während drei Linien Mutationen in allen vier Bra j I-Allelen aufwiesen. Die Mutationen wurden stabil an die T1-Nachkommen vererbt. Darüber hinaus zeigten Immunoblotting-Ergebnisse eine Abnahme oder ein vollständiges Fehlen des Bra j I-Proteins in den Samenextrakten ausgewählter T1-Linien. Diese Arbeit unterstreicht den Wert von Genom Editing Technologien für die Schaffung hypoallergener Lebensmittelpflanzen. Zweitens wurden zwei Baseneditoren entwickelt: TALE-abgeleitete DddA-basierte Cytosin-Baseneditoren (TALE-DdCBEs) und TALE-abgeleitete Adenin-Baseneditoren (TALE-ABEs). Sie wurden entwickelt, um eine präzise Bearbeitung von C•G-to-T•A bzw. A•T-to-G•C zu erstellen. TALE-DdCBEs, die DddA-Varianten (DddA6 oder DddA11) enthielten, zeigten eine deutliche Verbesserung der Editierungseffizienz sowohl in Nicotiana benthamiana als auch in Reisprotoplasten. TALE-DdCBEs mit DddA11 wiesen eine bessere Sequenzkompatibilität für die Bearbeitung von Nicht-TC-Zielen auf. Darüber hinaus wurden verschiedene TALE-ABEs mit unterschiedlichen Desaminase-Fusionsarchitekturen in Reis und N. benthamiana getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass TALE-ABEs A•T-to-G•C Umwandlungen im Reisprotoplasten ermöglichen. TALE-Base-Editoren können für nukleare Gene eingesetzt werden oder alternativ über N-terminale Targeting-Sequenzen die Genome von Plastiden oder Mitochondrien zum Ziel haben.

Organisationseinheit(en)

Abteilung Pflanzenbiotechnologie

Typ

Dissertation

Anzahl der Seiten

127

Publikationsdatum

2023

Publikationsstatus

Veröffentlicht

Elektronische Version(en)

https://doi.org/10.15488/14747 (Zugang: Offen)